人源諾如病毒（HuNoVs）是導(dǎo)致急性胃腸炎的主要病原體。由于缺乏合適的培養(yǎng)系統(tǒng)，HuNoVs的發(fā)病機(jī)制以及疫苗和藥物的開發(fā)進(jìn)展緩慢。雖然研究人員在上個(gè)世紀(jì)采用了多種方法在體外培養(yǎng)HuNoVs（圖1），但病毒無法穩(wěn)定增殖、病毒滴度低、重復(fù)試驗(yàn)不穩(wěn)定等問題仍然不可忽視。

圖1 諾如病毒體外培養(yǎng)方法^[1]

背景介紹

諾如病毒可分為10個(gè)基因群（genogroups）和48個(gè)基因型（genotypes），而與人類感染相關(guān)的有五個(gè)基因群：GI、GII、GIV、GVIII和GIX。全球50%的諾如病毒疫情與GII.4基因型相關(guān)，自1990年代以來，該基因型的病毒株導(dǎo)致了六次大流行。在2014年冬季，GII.17在亞洲出現(xiàn)，逃逸了群體免疫，引發(fā)了中國和日本的廣泛爆發(fā)，并在某些地區(qū)取代了GII.4。近年來，非GII.4病毒如GII.2和GII.3也在多個(gè)國家引發(fā)大規(guī)模疫情。

腸道上皮細(xì)胞系

腸道上皮細(xì)胞是HuNoVs從粘膜表面侵入內(nèi)部時(shí)首先接觸到的細(xì)胞類型。在陽性患者的近端小腸活檢中觀察到的病理特征包括絨毛縮短、黏膜炎癥以及腸道上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象，伴有微絨毛縮短。此外，對(duì)一名急性HuNoVGII.4悉尼毒株腹瀉的兒科腸移植患者不同部位的腸道活檢組織進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，人類諾如病毒靶向腸內(nèi)分泌細(xì)胞（EECs），這是一種具有感覺和內(nèi)分泌功能的特化上皮細(xì)胞。這些跡象表明腸道上皮細(xì)胞與HuNoV感染過程密切相關(guān)，因此研究人員最初試圖在腸道上皮細(xì)胞中培養(yǎng)HuNoVs。

White等人特意將放射性標(biāo)記的重組諾如病毒病毒樣顆粒VLPs結(jié)合到13種不同的細(xì)胞系上，發(fā)現(xiàn)分化的人結(jié)腸癌細(xì)胞（Caco-2）與 VLPs的結(jié)合最多，顯著高于未分化的Caco-2細(xì)胞和其他細(xì)胞。與此同時(shí)，當(dāng)Duizer等人嘗試將HuNoVs接種到包括Caco-2在內(nèi)的八種人腸道上皮細(xì)胞系時(shí)，發(fā)現(xiàn)沒有一種細(xì)胞系能夠?qū)崿F(xiàn)顯著的基因拷貝數(shù)增加或新感染病毒的產(chǎn)生。

抗原呈遞細(xì)胞

抗原呈遞細(xì)胞（APCs）是一類能夠攝取和處理抗原并將其呈遞給T細(xì)胞的免疫細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞（MΦ）、樹突細(xì)胞（DCs）和B細(xì)胞。Wobus等人于2003年發(fā)現(xiàn)了第一株小鼠諾如病毒（MNV），并隨后發(fā)現(xiàn)MNV能夠在DCs和MΦ中有效復(fù)制，因此建立了諾如病毒的首個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。盡管小鼠無法感染HuNoVs，但通過低劑量注射HuNoV VLPs可以在體內(nèi)刺激IgG和IgA介導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng)，因此推測(cè)HuNoVs在感染宿主后也會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞適應(yīng)性免疫反應(yīng)。Ponterio等VLPs能夠誘導(dǎo)APCs的激活和成熟。然而，當(dāng)HuNoVs與來自易感個(gè)體的單核細(xì)胞亞群衍生的DCs和MΦ在體外培養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)部分外周血單核細(xì)胞衍生的DCs能夠表達(dá)病毒VP1和VPg蛋白，但所有細(xì)胞中的病毒RNA拷貝數(shù)并未增加；2014年，Jones等人成功將HuNoVs GII.4毒株、MNV-1和MNV-3接種到B細(xì)胞系（BJAB細(xì)胞系）中，增加了病毒拷貝數(shù)并產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)/非結(jié)構(gòu)蛋白，進(jìn)一步證明了通過傳代實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生新感染病毒顆粒的可能性。然而該團(tuán)隊(duì)強(qiáng)調(diào)了實(shí)驗(yàn)成功需要考慮的多種因素；接種液必須是未經(jīng)過濾的病毒陽性糞便上清液，因?yàn)槟c道微生物的存在是HuNoV感染的重要共同因子。此外，參與的B細(xì)胞類型（可以在BJAB和Raji細(xì)胞中復(fù)制，但不能在Namalwa和HuNS1細(xì)胞系中復(fù)制）、它們的狀態(tài)和密度也會(huì)影響感染的效率，此外還有培養(yǎng)基中胎牛血清的來源。盡管這個(gè)體外培養(yǎng)系統(tǒng)最初取得了一定成功，但仍然存在一些問題。這個(gè)培養(yǎng)系統(tǒng)只能適度增加HuNoV基因組拷貝數(shù)，不能產(chǎn)生體內(nèi)觀察到的病毒復(fù)制水平。

3D細(xì)胞聚集體

幾十年來，HuNoVs的二維單層細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)一直以失敗或低效率告終。在感染病毒的活體動(dòng)物中，細(xì)胞在三維環(huán)境中協(xié)同工作，這種空間環(huán)境可能對(duì)病毒或其他傳染病原體的感染至關(guān)重要。

1998年，美國國家航空航天局（NASA）報(bào)告了使用旋轉(zhuǎn)壁反應(yīng)器（RWV），該反應(yīng)器模擬微重力和低流體剪切環(huán)境，使得其中培養(yǎng)的細(xì)胞能夠形成極性和三維聚集體；這使得能夠有效重建原生組織的結(jié)構(gòu)，并模擬人類微環(huán)境。自引入以來，研究人員使用該反應(yīng)器培養(yǎng)來自多個(gè)器官（淋巴、肺、腎、胃、腸、陰道等）的細(xì)胞聚集體，并深入探討所涉及病毒的發(fā)病機(jī)制。Straub等人應(yīng)用RWV技術(shù)，成功地在3D人胚小腸上皮（INT 407）聚集體中培養(yǎng)了兩種HuNoV毒株（GI.1和GII.4），并進(jìn)行了多次傳代。感染HuNoVs一天后，細(xì)胞聚集體表現(xiàn)出空泡化和微絨毛縮短，從細(xì)胞載體上脫落；它們還呈現(xiàn)出細(xì)胞病理效應(yīng)（CPE），細(xì)胞形態(tài)變得延長或扭曲。隨后，研究團(tuán)隊(duì)在Caco-2的3D聚集體中培養(yǎng)了兩種HuNoV毒株GI.1和GII.4；在感染的聚集體中顯示出2–3 Log10的病毒RNA拷貝數(shù)。然而，其他實(shí)驗(yàn)室在使用相同方法培養(yǎng)3D聚集體的INT 407或Caco-2細(xì)胞后，沒有病毒復(fù)制的跡象；不過觀察到了細(xì)胞分化和頂端絨毛的形成。

人類腸道類器官（HIE）

2009年Hans Clevers團(tuán)隊(duì)成功地在體外培養(yǎng)了小鼠腸道干細(xì)胞，使其在非上皮生態(tài)位中形成具有多種分化細(xì)胞類型（包括干細(xì)胞、腸細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和腸內(nèi)分泌細(xì)胞）的絨毛腸上皮結(jié)構(gòu)域，這些細(xì)胞具有長時(shí)間生長的能力。自那時(shí)以來，這項(xiàng)技術(shù)迅速發(fā)展，創(chuàng)造了腸道、腦、胃、肺、卵巢等多種類型的類器官。類器官能夠模擬和反映人類器官在不同環(huán)境中的狀態(tài)，因此被廣泛應(yīng)用于病原微生物感染、藥物開發(fā)和篩選、再生醫(yī)學(xué)和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域。

人類腸道類器官（HIE）包含具有隱窩樣增殖區(qū)的腸上皮的主要細(xì)胞類型。結(jié)合上皮單層細(xì)胞系的高通量與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腸道的復(fù)雜性，HIE在研究人類腸道相關(guān)疾病方面得到了廣泛應(yīng)用，并為各種病毒的體外培養(yǎng)提供了新的方向

2016年，Mary K. Estes團(tuán)隊(duì)培養(yǎng)了來源于空腸的單層HIE，系統(tǒng)有效表征了不同亞型HuNoVs的復(fù)制（在96小時(shí)后，HuNoV基因組RNA增加了1.5–2.5 log10，感染細(xì)胞占35–45%，透射電子顯微鏡下可觀察到典型的病毒顆粒結(jié)構(gòu)）和傳代（四次連續(xù)傳代存在病毒的感染性后代的產(chǎn)生）。研究人員發(fā)現(xiàn)，膽酸等添加劑能夠促進(jìn)GII.3和GII.17兩個(gè)亞型的復(fù)制，并促進(jìn)GII.4亞型的復(fù)制；這項(xiàng)研究代表了HuNoVs體外培養(yǎng)的重大突破，極大推動(dòng)了對(duì)HuNoVs的基礎(chǔ)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果被多個(gè)國家的實(shí)驗(yàn)室成功驗(yàn)證，多種HuNoVs基因型（GI.1、GII.1、GII.2、GII.3、GII.4、GII.6、GII.8、GII.12、GII.14和GII.17）實(shí)現(xiàn)復(fù)制。

斑馬魚模型

斑馬魚因其發(fā)育透明、易于遺傳操作以及具有與人類相似的免疫系統(tǒng)，成為了研究病毒與宿主相互作用的重要模型。在諾如病毒的研究中，科學(xué)家們利用斑馬魚的胚胎和幼魚模型發(fā)現(xiàn)，諾如病毒能夠感染斑馬魚的腸道上皮細(xì)胞，通過模仿人類的感染途徑，斑馬魚模型幫助科學(xué)家解析諾如病毒如何與宿主細(xì)胞結(jié)合、進(jìn)入細(xì)胞以及復(fù)制的詳細(xì)過程。

在斑馬魚幼蟲中復(fù)制在感染后第天達(dá)到峰值，至少可在6天內(nèi)檢測(cè)到。HuNoV GII.4 可以在幼蟲之間連續(xù)傳代2次?？共《局委熆蓹z測(cè)到HuNoV復(fù)制減少了>2 log10，表明該模型適用于抗病毒研究。斑馬魚模型為篩選抗諾如病毒藥物提供了一個(gè)有效的平臺(tái)。通過在感染斑馬魚中測(cè)試不同的化合物，研究人員可以快速評(píng)估這些藥物的活性，進(jìn)而為疾病的治療提供新的思路。

參考文獻(xiàn)：[1] Cheng C, Cai X, Li J, Zhang X, Xie Y, Zhang J. In Vitro Culture of Human Norovirus in the Last 20 Years. Biomedicines. 2024, 24;12(11):2442.

來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~薛亮。